在光绪帝喝下毒药，尚未发作时，慈禧太后已经命人将皇帝梓宫停在乾清宫，预备发丧（慈禧太后估算光绪帝当晚即死，没有想到光绪帝在中毒后仍然坚持了四天）。由此可以判定，下毒之人必为慈禧太后，因为其他人没有调动皇帝梓宫的权力。
清光绪帝的死因，100多年来一直是史学界争论的焦点。“清光绪帝死因专题研究课题组”于2008年公布的一份采用现代刑侦和高科技手段检测的1万字报告显示：光绪头发中含有高浓度的砷元素，且各截段含量差异很大，第1缕头发的砷高峰值出现在第10段(2404μg/g)，第2缕头发的砷高峰值出现在第26段(362.7μg/g)和第45段(202.1μg/g)。
袁世凯毒死说，史料记载，袁世凯戊戌事件告密有功，深受慈禧以及荣禄重用，光绪帝对他是切齿痛恨。倘若光绪重掌权政，定会处罚袁世凯，而袁世凯也深知如此。故有“袁世凯毒死说”一说。
